Компания eGenesis, которая специализируется на производстве генетически модифицированных свиней для пересадки органов человеку, сообщила о рождении многократно отредактированных животных. Они потеряли три гена, приобрели девять, а также лишились 25 размножающихся в геноме вирусов. При этом свиньи совершенно здоровы и фертильны, а их клетки не вызывают агрессии у компонентов человеческой иммунной системы. Клинические испытания пересадок на людях планируются в ближайшие годы. Препринт работы выложен на портале bioRxiv.
На пути к трансплантации животных органов человеку стоят три препятствия. Первое — физиологическая совместимость: орган должен подходить по размеру, строению и функциям. В этом смысле удобным объектом является свинья, многие органы которой — например, сердце или почки — несущественно отличаются от человеческих.
Второе препятствие — иммунное отторжение. Организм человека реагирует настороженно на любые незнакомые молекулы, но некоторые — например, сахара на поверхности чужих клеток — вызывают особенно сильную агрессию.
Наконец, третье — это вирусы, которые носит в своем геноме каждый организм. Речь идет не об активных вирусах, которые вызывают эпидемии, а об эндогенных, то есть таких, которые не убивают клетку, а размножаются только в пределах ее ядра. Но если собственные вирусы клетка еще как-то держит под контролем, то если чужие клетки заразят ее новыми вирусами, то с последствиями их размножения она может не справиться.
Для того, чтобы орган свиньи стал совместим с человеком, с учетом всех этих требований, необходимо внести изменения сразу в ряд генов. Сначала этого пытались добиться посредством генных нокаутов, и сердце свиньи с несколькими нокаутами продержалось в организме павиана целых три года.
Но в 2015 году американский генетик Джордж Черч и китайский биолог Лухань Ян основали компанию eGenesis, целью которой стало создание свиней, модифицированных сразу по множеству генов. Через некоторое время ученые во главе с Черчем отчитались о том, что им удалось полностью очистить клетки свиней от эндогенных ретровирусов. Теперь же Черч и Ян сделали следующий шаг: создать одновременно «безвирусных» и иммунологически совместимых животных.
Для этого исследователям из eGenesis пришлось разработать многоступенчатый протокол. Для начала они взяли культуру фибробластов из уха обычной свиньи. С помощью электропорации в них ввели молекулы системы CRISPR/Cas9 чтобы вырезать из ДНК три гена, которые вызывают наиболее сильное отторжение в организме человека. Одновременно с тем в клетки ввели плазмиду с девятью новыми, уже человеческими генами, которые отвечают за подавление иммунного ответа и процессов свертывания крови. Таким образом, получившиеся клетки должны были не только не вызывать иммунную агрессию, но и подавлять ее.
Убедившись в том, что редактирование прошло успешно, ученые извлекли ядра фибробластов и поместили их в безъядерные яйцеклетки — это давно отработанный метод клонирования. Из яйцеклеток развились зародыши, которые подсадили суррогатным матерям, а те родили поросят первого поколения. Эти поросята еще несли в себе вирусы, но уже должны были получиться иммунологически совместимы с человеком.
Из их организма ученые снова выделили культуру фибробластов и провели в ней следующий этап редактирования: опять же, с помощью электропорации в клетки ввели систему CRISPR/Cas9, которая атаковала ген обратной транскриптазы — ключевого фермента, с помощью которого в геноме размножаются эндогенные вирусы. После этого ядра клеток так же выделили, поместили внутрь яйцеклеток и получили поросят второго поколения. Свиньи, таким образом, потеряли три гена, получили девять, и так же лишились двадцати пяти активно размножающихся вирусов.
Исследователи проверили, что отредактированные свиньи генетически стабильны. В их клетках действительно экспрессировались восемь из девяти человеческих генов и «молчали» гены, вызывающие иммунное отторжение. Ученые проверили геном животных на следы нецелевого (офф-таргет) редактирования и нашли несколько «промахов» CRISPR/Cas9, однако они не затронули белок-кодирующие участки ДНК.
Сами животные при этом были физиологически здоровы и фертильны. Несмотря на вмешательство в их иммунитет и систему свертывания крови, их анализы крови были в пределах нормы. Никакого влияния редактирования на работу сердца, печени и почек свиней ученые тоже не обнаружили.
Наконец, исследователи проверили, приобрели ли генетически отредактированные свиньи требуемые для трансплантации свойства. Сначала они выделили культуру клеток из стенок сосудов свиней и обработали ее человеческими иммуноглобулинами: они связывались с модифицированными клетками на 90 процентов меньше, чем с обычными. Затем на эти клетки подействовали человеческими белками комплемента — они реагируют на присутствие чужеродных клеток даже раньше, чем иммуноглобулины — но система комплемента активировалась не чаще, чем в случае с собственными, человеческими клетками.
Таким образом, ученым удалось создать животных, клетки которых не вызывают немедленной агрессии человеческого иммунитета. Несмотря на то, что иммунная система может среагировать на чужеродные клетки потом, распознав на них более редкие белки, с этим можно справиться с помощью иммуносупрессоров. Редактирование же позволяет избежать острого отторжения и выиграть время, за которое орган успеет прижиться внутри тела. В интервью Science Ян уточнила, что в 2020 году компания планирует сосредоточиться на доклинических испытаниях, но рассчитывает перейти к исследованиям на людях в ближайшие пять лет.