Американские исследователи с помощью системы CRISPR-Cas9 нокаутировали («выключили») у кальмаров Doryteuthis pealeii ген триптофан-2,3-диоксигеназы, чья активность в норме приводит к образованию пигментов, сообщается в Current Biology. Гены головоногих моллюсков ученые до этого не модифицировали. Процент успешных нокаутов оказался очень высок, а это значит, что метод имеет хорошие перспективы применения.
Головоногих моллюсков — кальмаров, каракатиц, в меньшей степени осьминогов — сейчас все чаще используют в качестве модельных животных, как это делают с мышами и крысами. Однако в случае грызунов опыта и возможностей у ученых пока что больше: существует масса линий («пород») мышей, чьи гены модифицированы под конкретные исследовательские нужды, а трансгенных головоногих еще никто не делал. Между тем сами кальмары легко меняют работу собственного генетического материала: они способны редактировать свою РНК как в ядре, так и за его пределами, и за счет этого фактически кодировать одним геном несколько разных по составу белков.
Джошуа Розенталь (Joshua Rosenthal) и его коллеги из Лаборатории морской биологии Чикагского университета попробовали изменить ДНК головоногого моллюска с помощью системы CRISPR-Cas9. В качестве подопытного животного они выбрали кальмара Doryteuthis pealeii — хорошо изученный вид, удобный еще и тем, что существует методика его искусственного оплодотворения, а его эмбрионы почти прозрачные.
Нокаутировать решили ген, чье выключение, с одной стороны, будет хорошо заметно у таких организмов, а, с другой стороны, не приведет к угрожающим жизни последствиям. Это ген tdo — триптофан-2,3-диоксигеназы, фермента, который у беспозвоночных начинает превращение триптофана в пигменты тела. Соответственно, если tdo не будет функционировать, кальмар вырастет бесцветным.
Введение CRISPR-Cas9 в эмбрионы кальмара. Масштабный отрезок 250 микрометров.
Karen Crawford et al. / Current Biology, 2020
Направляющие РНК, способные связываться с экзонами (кодирующими, смысловыми участками) гена триптофан-2,3-диоксигеназы, и другие компоненты системы CRISPR-Cas9 вводили в клетки эмбрионов кальмаров через 1,5–2,5 часа после оплодотворения, на стадии, когда ядро яйцеклетки еще не слилось с ядром сперматозоида и не произошло первого деления дробления. До этого момента сложнее попасть в область, где находятся оба ядра (диск, видимый на рисунке выше), а после, когда клеток станет больше, необходимо будет ввести CRISPR-Cas9 в ядро каждой, что очень трудоемко.
Эмбрион из контрольной группы (видны окрашенные хроматофоры и более темные глаза) и эмбрион с нокаутированным геном tdo
Выживаемость была максимальной у тех эмбрионов, которым ген триптофан-2,3-диоксигеназы нокаутировали через два часа после оплодотворения. «Выключить» tdo удавалось в 35-95 процентах случаев, в среднем примерно в 90 процентах. Те кальмары, которым вводили CRISPR-Cas9, были лишены окрашенных хроматофоров (структур с пигментными клетками), и другое крупное скопление пигментов, глаза, имели розовый или светло-коричневый цвет, в то время как у животных контрольной группы они темно-коричневые.
Пока Doryteuthis pealeii не умеют массово выращивать в неволе, и поэтому, вероятно, в ближайшее время генетические линии этих кальмаров получить не удастся. Тем не менее эмбрионы моллюсков с нокаутированными генами можно использовать в исследованиях в области биологии развития. Авторы ожидают, что их технологию начнут применять и другие группы ученых, которые ставят эксперименты на головоногих моллюсках.
